تعرفه خدمات فنی و مهندسی کشاورزی تهیه شده توسط سازمان نظام مهندسی کشاورزی، ابلاغ شده توسط وزیر جهادکشاورزی ثبت نام دوره آموزش مجازی کارآفرینی کشاورزی

نسخه قابل چاپ

مطلب قبلی

صفحه اصلی

مطلب بعدی

آرشیو ماهانه

    بهینه سازی بازﻳافت DNA از ارقام مختلف گندم( .aestivumTriticum) سیمین سارانی 1* ـ فاطمه مصری 1ـ عباسعلی امام جمعه 2 ـ احمد قنبری2   

دریافت فایل اصلی مقاله در قالب Word

بهینه سازی بازﻳافت DNA از ارقام مختلف گندم( .aestivumTriticum)
سیمین سارانی 1* ـ فاطمه مصری 1ـ عباسعلی امام جمعه 2 ـ احمد قنبری2
1ـ کارشناس پژوهشی  2ـ عضو هیات علمی  دانشکده کشاورزی
استان سیستان و بلوچستان ـ شهرستان زابل ـ میدان جهاد ـ مرکز بیوسنتر
تلفن :22240696-0542
smnsarani@yahoo.ca
چکیده :
بازیافت DNA با اهداف متفاوت ژنتیکی صورت می گیرد که یکی از این اهداف توالی یابی DNA می باشد. لذا ضرورت دارد که مراحل بازیافت DNA برای هر گونه گیاهی بهینه شود .
 به منظور بهینه سازی شرایط باز یافت DNA از ارقام مختلف گندم ، تحقیقی در آزمایشگاه ژنتیک مولکولی دانشگاه زابل صورت گرفت .DNA این ارقام به روش دلاپورتا استخراج ، پس از تعیین غلظت نمونه ها برای تکثیر قطعات DNA الگو از پرایمرهای تصادفی و نیمه تصادفی استفاده شد . پس از الکتروفورز محصولات حاصل از PCR برروی ژل آگارز 1% ، باندهای تکثیری که از کیفیت و وضوح خوبی برخوردار بودند انتخاب و از روی ژل جدا شده و روشهای مختلف برای بازیافت DNA  استفاده شد که مناسبترین روش بازیافت ، استفاده از PCR مجدد و ته نشین کردن DNA حاصله با اتانول بود . که در این روش باند جدا شده از ژل پس از سانتریفیوژ لحظه ای ،به مدت 15 دقیقه در دمای 70- قرار داده شد و سپس  در دمای 65 درجه حمام آب گرم قرار داده شد تا باند ذوب شود پس از آن باند ذوب شده را در تریس حل کرده و از این محلول به عنوان ماده اصلی مجدداً برای PCR استفاده گردید . PCR با همان شرایط PCR اولیه صورت گرفت و محصولات PCR الکتروفورز گردیده و در صورت تشکیل باند،باند حاصله را با اتانول ته نشین کرده که این DNA ته نشین شده آماده توالی یابی میگردد .
واژگان کلیدی : گندم،بازیافت،ژل،آگارز

مقدمه:
گندم مهمترین غله ایران ودنیا است.(1)مبدأ اصلی گندم به عنوان مهمترین غله ایران وجهان در جنوب غربی آسیا بوده و10تا 15 هزار سال قبل از میلاد مسیح از این گیاه در تغذیه انسانها استفاده می شده است.(2)دامنه وسیع وسازگاری زیاد این گیاه وهمچنین مصارف متنوع این غله در تغذیه انسانها باعث گردیده که بعنوان مهمترین غله جهان بویژه در کشورهای در حال توسعه وجهان سوم مطرح گرددو حدود 20درصد منابع غذایی مردم جهان را تشکیل  دهد.(3) در ایران سرانه مصرف گندم برای هر فرد 150 تا200 کیلو گرم می باشد.(7)با توجه به روند رو به افزایش جمعیت ، در کشورهای در حال توسعه وایران واهمیت اقتصادی  وسیاسی تولید این گیاه باید نگاهی ویژه، به تولید واصلاح آن داشت. از طرف دیگر محدودیت ارقام سازگار به خشکی، شوری،سرماومقاوم به بیماریها وآفات وسازگار با شرایط موجود در مناطق مختلف یکی دیگر از عواملی است که تولید این غله را در کشورهای در حال توسعه وایران با بحران روبرو نموده است.(1)ورود مداوم ا رقام اصلاحی از خارج از کشورنیز به علت ایجاد وابستگی کشور به دیگر کشورها مقرون به صرفه نمی باشد.(2) لذانیاز به اصلاح این گیاه وبهره گیری از ارقام محلی ،بومی  وخویشاوندان وحشی آنها با توجه به تنوع ژنتیکی بالا ودارا بودن صفاتی چون مقاومت به بیماریها ،آفات ،خشکی ،سرما وشوری بر هیچکس پوشیده نیست.
توالی یابی DNA یکی از کاربردهای واکنش زنجیره ای پلیمراز می باشد که بدین منظور بایستی محصولات حاصل از PCR را از ژل آگارز بازیافت نمود . (5)
برای هر گونه روش توالی یابی ، در اختیار داشتن مقدار نسبتاً زیادی از قطعه های یکسان DNA تک رشته ای ضروری است (6)
خلوص بالای نمونه های  DNA برای توالی یابی ضروری است ، تا نتایج حاصل از توالی یابی از کیفیت خوبی برخوردار باشد ، روشهای مختلف مورد استفاده برای خالص سازی DNA بایستی بتواند از محصولات PCR ، نمونه های DNA  خالص با غلظت مناسب بدست آورد.
برای  توالی یابی قطعات  DNA مربوط به فراورده های PCR    روشهای متعددی وجود دارند که امکان تعیین سریع توالی مورد نظر را فراهم می آورند.
توالی یابی مستقیم فراورده های PCRاین امكان را فراهم می آوردتا ویژگیهای توالیهای مورد نظر بدون نیاز به کلون کردن فرعی یا زیر کلونسازی سریعأ تعیین شوند.مزیت دیگر آن در اینست که اشتباهات ناشی از    که در فراوده های تکثیری مشاهده می گردند،تشخیص داده نمی شوند.چرا که این اشتباهات باید به ندرت در موقعیتهای تصادفی در قطعه تکثیری بوقوع بپیوندند.
توالی یابی توده بزرگی از مولکولهای موجود در DNAتکثیر یافته امکان تشخیص اشتباهات PCRرا ازبین می برد،مگر اینکه PCRبر روی مقادیر بسیار کمی از DNAالگو انجام شود،در اینصورت این امکان وجود دارد که اشتباهی در اوایل تکثیر PCR رخ دهد و در نهایت بتوان آن را در فراورده های نهایی PCR  تشخیص داد. بنابراین پس از توالی یابی مستقیم ،یک توالی عمومی ازمولکولهای DNA  در مخلوط واکنش  PCR حاصل می گردد.(5)
مواد وروشها:
این تحقیق درسال  1384 در آزمایشگاه ژنتیک مولکولی وابسته به مرکز زیست پژوهشی علوم سلولی ومولکولی (بیوسنتر) دانشگاه زابل صورت گرفت. 
مواد گیاهی :
تعداد 12 رقم ولاین گندم  از کلکسیون بذر ومرکز تحقیقات زابل تهیه شد که این ارقام شامل:
Pethneer-2123/Hirmand,V.8187/Arvand-7,Pethneer-2123/Bolani,Hirmand ,Kalak Afghan,Star,Kavir ,Vees/3/Bows/Vees/Kaf/4/Bolani,Alvand,Mahdavi ,Bolani,Hamoon.
بذور در داخل گلدانهایی کشت واز برگهای سبز برای استخراج DNA    استفاده گردید.     
استخراج DNA:
استخراج DNAازنمونه های گیاهی با روش دلاپورتا وهمکاران(Dellaporta et al 1993) انجام شد.(8)
برای تعیین کمیت وکیفیت DNA  ازدو روش الکتروفورز برروی ژل آگارز وبیوفتومتر استفاده شد.
واکنش زنجیره ای پلیمراز:
در این تحقیق  برای تکثیر قطعات   DNA  الگو از پرایمرهای  تصادفی ونیمه تصادفی  استفاده شد، واکنش زنجیره ای پلیمراز با حجم 25 میکرولیتر حاوی بافر PCR ،کلرور منیزیم ، پرایمر ،   dntp ،آنزیم Taq و 30 نانوگرم از DNA ژنومی از هر نمونه انجام گردید .
برای واکنش زنجیره ای پلیمراز در دستگاه ترموسایکلر از دو نوع برنامه حرارتی استفاده گردید .
مرحله اول واسرشت سازی ،به مدت 50 ثانیه در دمای 94 درجه سانتیگراد .
مرحله دوم اتصال ،برای پرایمر های تصادفی به مدت 50 ثانیه در دمای 34 درجه سانتیگراد
و برای پرایمرهای نیمه تصادفی به مدت 50 ثانیه در دمای 50 درجه سانتیگراد

دریافت فایل اصلی مقاله در قالب Word

یکشنبه 21 مرداد 1386| Tuesday 17 Apr 2012

-----